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雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒實(shí)驗原理與應用方向(雙熒光素酶活動(dòng))

更新時(shí)間:2024-06-24      點(diǎn)擊次數:710

活動(dòng)預覽:文末含李記生物Firefly & Renilla雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒推薦的活動(dòng),獎勵內含騰訊會(huì )員、音樂(lè )會(huì )員等,6月28日就kai獎啦,快來(lái)參與吧!

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— 實(shí)驗原理 —

螢火蟲(chóng)熒光素酶是一種分子量約為61KD的蛋白,在A(yíng)TP、鎂離子和氧氣存在的條件下,可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin,在Luciferin 氧化的過(guò)程中,會(huì )發(fā)出生物熒光。

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圖1.螢火蟲(chóng)熒光素酶催化反應原理

海腎熒光素酶是一種分子量約為36KD的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide,在Coelenterazine 氧化的過(guò)程中也會(huì )發(fā)出生物熒光。

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圖2.海腎熒光素酶催化反應原理

雙熒光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時(shí)表達螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶,螢火蟲(chóng)熒光素酶作為報告基因反應目的基因表達的改變,海腎螢光素酶作為內參基因,提供轉錄效率的對照(減少內在變化因素如培養細胞的數目,細胞轉染和裂解的效率對實(shí)驗準確性的影響)。兩種熒光素酶沒(méi)有種屬同源性并對應不同的反應底物,故而沒(méi)有交叉干擾。

— 應用方向 —

一、靶基因驗證

miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻譯),將目的基因3’UTR(野生型和結合位點(diǎn)突變型)序列構建至載體中報告基因Luc的3’端,通過(guò)比較過(guò)表達miRNA后,報告基因表達的改變(螢光素酶的活性下降還是不變),明確miRNA的作用及miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

圖3.靶基因驗證實(shí)驗設計原理


相關(guān)實(shí)驗適用類(lèi)型:miRNA-靶基因(mRNA、LncRNA、circRNA)、m6A位點(diǎn)、增強子

二、啟動(dòng)子活性驗證

轉錄因子主要通過(guò)作用于靶基因的啟動(dòng)子起作用,將目的基因啟動(dòng)子區序列構建在報告基因Luc的5’端,通過(guò)共表達轉錄因子后,根據報告基因表達的改變,來(lái)確定轉錄因子與靶基因啟動(dòng)子結合位點(diǎn)及對靶基因的作用。

圖4.啟動(dòng)子驗證實(shí)驗設計原理


— 應用示例 —

1、示例一

文章標題:METTL14/miR-29c-3p axis drives aerobic glycolysis to promote triple-negative breast cancer progression though TRIM9-mediated PKM2 ubiquitination

發(fā)表期刊:Journal of cellular and molecular medicine

和元助力:將WT TRIM9-3’UTR 和突變型 TRIM9-3‘UTR 構建至pMIR-REPORT載體,通過(guò)共轉染miR-29c-3p mimics, miR-29c-3p inhibitor和 miRNA-NC,明確了miR-29c-3p與TRIM9的結合。


2、示例二

文章標題:The ELAVL3/MYCN positive feedback loop provides a therapeutic target for neuroendocrine prostate cancer

發(fā)表期刊:Nature communications

和元助力:為了闡明MYCN轉錄調控的分子機制,作者分別將ELAVL3的全長(cháng)以及Segments A, B, C的啟動(dòng)子構建到luciferase報告基因載體上。通過(guò)雙熒光素酶報告基因實(shí)驗,發(fā)現MYCN顯著(zhù)上調full-length ELAVL3和ELAVL3 Segment A兩組的luciferase信號,證明了MYCN對 ELAVL3的轉錄調控。

3、示例三

文章標題:METTL3 facilitates stemness properties and tumorigenicity of cancer stem cells in hepatocellular carcinoma through the SOCS3/JAK2/STAT3 signaling pathway

發(fā)表期刊:Cancer gene therapy

和元助力:SOCS3的CDS區,包含m6A識別位點(diǎn)野生型(GGACU)以及突變型(CCTGA),被構建在pMIR-REPORT載體上。通過(guò)過(guò)表達和干擾METTL3的表達,同時(shí)利用雙熒光素酶報告基因實(shí)驗證實(shí)了METTL3和SOCS3的相互作用。


/ 雙熒光素酶活動(dòng) /

活動(dòng)時(shí)間:即日起--6月28日

獎品(隨機抽取6位):送1年的年卡,有愛(ài)奇藝、騰訊視頻、優(yōu)酷、芒果、嗶哩嗶哩 、音樂(lè )、網(wǎng)易云音樂(lè )-(可挑選其中1張)

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活動(dòng)范圍:全國生物相關(guān)終端客戶(hù)

kai獎時(shí)間:2024年6月28日13:00

領(lǐng)取方式:3個(gè)工作日內聯(lián)系梁經(jīng)理兌獎,逾期視為自動(dòng)放棄

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注意事項:

關(guān)注微信公眾號后回復“雙熒光素酶"參與活動(dòng);

1、抽中送愛(ài)奇藝、騰訊視頻、優(yōu)酷、芒果、嗶哩嗶哩 、QQ音樂(lè )、網(wǎng)易云音樂(lè )-其中1張;

2、可轉贈,逾期視為自動(dòng)放棄;

3、小可愛(ài)們可以關(guān)注公眾號獲取活動(dòng);

4、活動(dòng)最終解釋權歸和元李記所有。

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